最新科研 | 上交瑞金医院&吉林大学：多组学研究表明短双歧杆菌M-16V可以缓解纳米聚苯乙烯引起的免疫失调

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最新科研 | 上交瑞金医院&吉林大学：多组学研究表明短双歧杆菌M-16V可以缓解纳米聚苯乙烯引起的免疫失调现代别墅装修,郧县人头骨化石,和总裁同居的日子,

作者：微生态

编译：微科盟索亚，编辑：微科盟索亚、江舜尧。

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导读2022年3月21日，上海交通大学医学院瑞金医院许春娣团队与吉林大学公共卫生学院李金华团队等人在Environment International发表题为《Multi-omics reveals that Bifidobacterium breve M-16V may alleviate the immune dysregulation caused by nanopolystyrene》的文章。微塑料污染物的毒性效应受到越来越多人们的关注。 基于表型和组学来评估微塑料对宿主毒性效应的综合策略仍有待建立。在本研究中，我们设计了一个包含表型分析和多组学分析的方法来探究纳米聚苯乙烯(nanopolystyrene，PS)暴露对小鼠的分子干扰。小鼠在1000μg/L的PS下暴露28天。我们发现PS诱导小鼠肠道微生物改变和代谢紊乱，这与免疫紊乱密切相关。此外，还观察到一些与免疫失调相关基因表达的改变。有趣的是，短双歧杆菌M-16V (Bifidobacterium breve M-16V，B. breve M-16V)显著抑制Th2和Th17淋巴细胞亚群。同时，短双歧杆菌M - 16V可激活MyD88表达，促进Th1相关细胞因子IL - 12的产生。此外，短双歧杆菌M - 16V可以部分恢复肠道微生物的失调。总之，我们的研究证明，将基于表型和组学的分析相结合，建立了一个实用的评估框架，能够更深入地了解PS暴露的不良后果。该方法还可用于其他环境微塑料污染物的毒性评价。同时，我们发现短双歧杆菌 M-16V通过宿主-微生物相互作用具有一定的抗炎症和免疫调节功能。

亮点：

1. 免疫检验表明了聚苯乙烯（PS）诱发Th2驱动的免疫毒性。

2. 肠道差异表达基因与PS诱导的免疫失调有关。

3. 微生物-宿主相互作用可能是PS诱导免疫毒性的机制。

4. 构建了一个分类算法来识别与PS暴露相关的免疫缺陷。

关键词：短双歧杆菌M-16V、微塑料、免疫、MyD88、肠道微生物、代谢

图文摘要

论文ID

原名：Multi-omicsreveals that Bifidobacterium breve M-16V may alleviate the immune dysregulation caused by nanopolystyrene

译名：多组学研究表明短双歧杆菌M-16V可以缓解纳米聚苯乙烯引起的免疫失调

期刊：Environment International

IF：9.621

发表时间：2022.03.21

通讯作者：许春娣，李金华

通讯作者单位：上海交通大学医学院瑞金医院，吉林大学公共卫生学院

DOI号：10.1016/j.envint.2022.107191

实验设计

选择两个月大的ICR小鼠为试验对象，随机分为3组（每组8只）：对照组（芝麻油，Control组）、暴露组（5μm 1000μg/L的PS，PS组）、干预组（5μm 1000μg/L的PS，2 × 108CFU/g的短双歧杆菌M-16V）。PS暴露一个月后，采集小鼠组织样本、血清样本、粪便样本。进行免疫学检验分析、组织病理切片分析、粪便16S rDNA测序分析、粪便代谢组分析、RT-PCR分析差异表达基因，并构建分类算法模型来识别与PS暴露相关的免疫缺陷。

结果

1 免疫检验揭示了纳米聚苯乙烯诱导Th2驱动的免疫毒性

通过免疫学指标综合分析，我们发现PS具有Th2细胞介导的环境免疫毒性（图1）。IL-4是Th2细胞的标志性细胞因子，在免疫反应中起重要作用。Th2细胞分化和2型细胞因子（包括IL - 4、IL - 5和IL - 13）的产生可能是2型免疫应答的中心事件。在本研究中，与对照组相比，PS组Th2细胞比例和IL-4水平均增强。这表明PS可能参与了2型免疫反应，引起包括哮喘、鼻炎和过敏反应在内的免疫病理状态。此外，有研究表明，Th2分泌的细胞因子IL-4可以抑制Th1细胞的产生。IL-12p70是促进细胞免疫的主要Th1驱动细胞因子。换言之，IL-12p70分泌水平可能与Th1细胞分化呈正相关，这支持了本研究中的发现。Th17细胞因子在自身免疫性和炎症性疾病的诱导和发生中起重要作用，而IL-12p70对Th17细胞的分化具有负面影响。这一结果同样也支持了本研究中的发现。孤儿核受体RORγt是Th17细胞分化的关键转录因子。此外，大多数位于小肠固有层的RORγt + T细胞表达IL-10和Treg标记物FoxP3，并具有调节功能。在没有RORγt + Treg的情况下，由Th2驱动的针对蠕虫的防御更有效，而Th2相关的病理则加剧。在我们的研究中，与对照组相比，PS组的Treg 细胞比例和RORγt水平降低。这些结果表明，RORγt + Treg缺乏加重了PS诱导的免疫紊乱。这些结果与我们的结果表明。PS的免疫毒性可能是由于抗原特异性Th2细胞功能亢进和Th1细胞显著减少，并伴随着相关细胞因子的异常分泌，导致2型免疫反应。有趣的是，关于短双歧杆菌M-16V在脾淋巴细胞分化中的作用，它对Th2和Th17淋巴细胞亚群的水平具有抑制作用。用短双歧杆菌M-16V进行饮食干预可抑制小鼠的过敏症状与Th2细胞的活化减少相关，这在一定程度上支持了本研究的结果。

图1. 纳米聚苯乙烯可能导致小鼠Th1/Th2失衡和2型免疫的发生。（A）血清中的细胞因子分泌水平；（B）脾脏中Th1、Th2、Th17和Treg细胞亚群的比例；∗P ≤0.05，∗∗P ≤0.01，∗∗∗P ≤0.001，∗∗∗∗P ≤0.0001。

2 肠道组织中关键基因的差异表达与纳米聚苯乙烯诱导的免疫失调有关

如图2A-B所示，PS下调了肠道组织中IL-10的表达。近几十年来，科研工作者对Treg细胞产生的抑制性细胞因子IL-10在抑制2型免疫应答中所起的重要作用进行了较为详细的研究。IL-10在位于小肠固有层的RORγt + T细胞中表达并具有调节功能。此外，PS对MyD88、TLR4和CCR5有抑制作用，短双歧杆菌 M-16V可能激活MyD88的表达。

此外，对显著改变的基因进行网络分析，发现TLR-MyD88信号传导在这些途径中至关重要（图2C）。研究已经证实了TLR- MyD88信号通路在宿主防御微生物病原体中的重要性。在MyD88缺失的情况下，免疫应答失调具有病原体依赖性，这表明了潜在的基因型-环境因素之间的相关性。有研究表明，CD4 + T淋巴细胞上CCR5表达与Th1免疫应答有关。随后，CCR5缺乏导致结肠炎小鼠由Th1向Th2反应转变。这与本研究中Th1/Th2平衡失调的结果基本一致（图2A - B）。此外，CCL11对Th2细胞敏化有重要影响。吸入OVA显著上调小鼠肺部CCL11的表达。这些结果支持了本研究的结果（图2A-B ）。

图2. PS改变了小鼠肠道组织的基因表达。（A）关键基因的表达情况;（B）不同基因表达情况的热图；从蓝色到粉红色的颜色渐变表明基因表达范围从低到高；（C）关键基因网络图与免疫调节有关；通过Cytoscape中的插件ClueGO进行差异表达基因的KEGG通路分析；∗P≤0.05，∗∗∗P≤0.001，∗∗∗∗P≤0.0001。）

3 整合多组学研究确定微生物-宿主相互作用是纳米聚苯乙烯诱导免疫毒性的潜在新机制

3.1 肠道微生物

肠道微生物组的破坏会影响免疫功能和代谢过程，导致多种疾病。为了进一步阐明微生物对免疫细胞的贡献，我们研究了与CD4 + T细胞相关的肠道微生物（图 3）。通过线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）效应大小（LEfSe）分析潜在的生物标志物（图 3A-B）。分析数据表明，乳酸杆菌属为对照组的优势菌属，普氏菌属可作为PS组的典型生物标志物，而短双歧杆菌M-16V处理后厚壁菌门占优势。换言之，短双歧杆菌 M-16V干预前后最明显的对比是普氏菌属的丰富度下降和厚壁菌门的丰富度增加。这些数据可作为快速识别PS暴露的辅助诊断方法。这些数据可能作为快速鉴别PS暴露的辅助诊断方法。在属水平上，垂直聚类丰度差异显著，而水平聚类丰度相对集中（图3C）。聚类分析显示，PS组的聚类距离与对照组和短双歧杆菌M - 16V处理组的差距最大（图3D）。基于加权UniFrac距离的PCoA对β -多样性的比较显示，三组间差异显著（ANOSIM R = 0.335，P =0.0001）（图3E）。

拟杆菌属（16.49%）、乳酸杆菌属（10%）和Alistipes属（6.05%）是对照组的优势菌属。PS组拟杆菌属占8.92 %，同时短双歧杆菌 M-16V处理组拟杆菌属占8.9 %；PS组乳酸杆菌属占6.1 %，同时短双歧杆菌M-16V处理组乳酸杆菌占11.79 %；Alistipes属在PS组占2.56 %，在短双歧杆菌M-16V处理占2.94 %（图3F-H）。如图3I-J所示，经PS处理4周的小鼠粪便样品中肠道微生物的组成在门和属水平上都与对照不同，表现为放线菌门比例较低，普氏菌属、Eisenbergiella属以及Intestinimonas属。短双歧杆菌M - 16V处理可能通过降低普氏菌属、Eisenbergiella属和Intestinimonas属的相对丰度来恢复部分肠道微生物的失调。有趣的是，普氏菌属与乳酸杆菌属和链球菌属密切相关（图3K）。研究表明，放线菌门是健康肠道的主要菌群。此外，普氏菌属、Eisenbergiella属以及Intestinimonas属被认为是促炎症微生物，这表现为免疫细胞释放的炎症介质增多。这些结果表明，PS可以诱导小鼠肠道微生物失调，并可能会刺激促炎症反应，加重免疫紊乱。同时，短双歧杆菌M - 16V具有一定的抗炎和免疫调节功能。通过测序数据PICRUSt2预测与PS暴露相关的潜在微生物功能。通过KEGG数据库对所鉴定微生物的功能通路进行了定位。在三组小鼠的肠道微生物中，KEGG功能模块识别出30个不同的预测类别（图3L）。PS组的氨基酰- tRNA生物合成、脂肪酸生物合成、次级胆汁酸生物合成以及其它聚糖降解的表达显著降低。另一方面，PS处理的样品中磷酸戊糖途径的表达量升高。有研究表明，涉及免疫代谢的主要微生物代谢途径包括糖酵解、磷酸戊糖途径、脂肪酸氧化与合成、氨基酸代谢和胆汁酸转化。这些机制是否与免疫调节有关还有待进一步研究。

图3. PS改变小鼠肠道微生物的组成。（A）根据线性判别分析效应大小（LEfSe）绘制的进化分支图，分类级别由大到小，最外环是门水平，最内环是物种水平；对照组为红色，PS组为绿色，M-16V组为绿色；（B）通过LEfSe计算细菌类群的相对丰度；每个条表示特定分类单元效应大小的log10（LDA score）；较高的LDA值表示为较长的条形图；绿色代表比对照更丰富的细菌类群，反之亦然；（C）在属水平上的物种丰富度聚类热图；颜色代表物种丰富度，从蓝色到红色的颜色渐变表明相对丰富度从低到高；（D）层次聚类树；不同处理样本颜色不同，分支的长度代表样本之间的距离，样品距离越近表明组成相似；（E）细菌群落的PCoA图；距离越近表示相似度越高，基于加权UniFrac距离的PCoA表明，三组之间的细菌组成存在显著差异（ANOSIM R = 0.335，P =0.0001）；（F-H）在属水平上的微生物组成的散点图；（F）对照组；（G）PS 组；（H）M-16V 组；（I）在门水平上的细菌群落相对丰富度；（J）在属水平上的细菌群落相对丰富度；（K）优势物种的网络分析；每个圆圈代表一个物种，圆圈的大小与相对丰度呈正相关，不同的颜色代表不同的物种；（L）预测的KEGG通路热图；在三组之间丰富度差异前30的通路；颜色代表功能的丰富度，颜色由浅到深表示功能的相对丰富度由低到高；∗P≤0.05，∗∗P ≤0.01，∗∗∗P ≤0.001。

3.2 微生物代谢产物

为了确定PS暴露过程中微生物代谢途径是否影响免疫细胞的代谢，我们采用非靶向LC-MS方法，探究小鼠粪便样品中微生物代谢产物的变化。相应的OPLS-DA模型显示出较好的数据质量。如图4A所示，证实了对照组和PS组之间存在显著的代谢组学差异（R2X = 0.153，R2X = 0.156）。基于OPLS-DA模型得到不同的代谢产物（VIP > 1，P < 0.05），并进行进一步分析。本研究采用200 ×排列检验来验证OPLS-DA模型的拟合度。如图4B所示，左边的Q2值均小于右边的原始Q2值，表明该模型有效，R2Y值和Q2值分别为0.9和-0.77。火山图显示，随着PS的添加，49个差异表达的代谢物中，14个上调，35个下调（图4C）。如图4D所示，PS暴露严重干扰了几种与氨基酸合成相关的代谢途径，包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和精氨酸的生物合成、d-谷氨酰胺和d-谷氨酸的代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢以及氨基酰-tRNA的生物合成。这与宏基因组数据预测功能在一定程度上相似。事实上，在PS暴露下具有显著改变的代谢物中，赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、L-组氨酸、N-乙酰天冬氨酸、L-酪氨酸等氨基酸的含量显著降低（图 4E）。构建了在这两种途径上富集的代谢物之间的相关网络图（图 4F-G）。与对照组相比，PS组4种在氨基酰-tRNA生物合成途径[赖氨酸、谷氨酰胺、 L-组氨酸、 L-酪氨酸 ]上富集的代谢物浓度较低（图4F）。随着代谢产物在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径上的富集，与对照组相比，谷氨酸在PS组中的表达量降低（图4G）。研究表明，氨基酸有助于免疫细胞获取能量所依赖的许多细胞内代谢途径。一项研究证明了这一点，其中谷氨酰胺代谢对促进 Th17 细胞具有明显的作用，但会限制 Th1 细胞分化。此外，PS 诱导苯丙酮酸的上调。有趣的是，如图4H所示，苯丙酮酸与上述氨基酸呈负相关，但这是否与免疫调节有关仍有待进一步研究。一项研究证明了这一点，其中谷氨酰胺代谢对促进Th17细胞具有明显的作用，但会限制Th1细胞分化。此外，PS诱导苯丙酮酸的上调。有趣的是，如图4H所示，苯丙酮酸与上述氨基酸呈负相关关系，但这是否与免疫调节有关还有待进一步研究。我们的研究结果表明，5μm的PS可引起小鼠肠道微生物失调和代谢紊乱。这些结果为PS暴露于陆地生态系统的潜在风险提供了新的视角，并证明了益生菌M-16V 的保护作用。

图4. PS 代谢产物的变化涉及氨基酸的生物合成。（A）OPLS-DA图（R2X[1] = 0.153，R2X[2] = 0.156）；圆圈表示对照组，三角形表示PS组；R2X[1]：模型第一主成分的可解释性；R2X[2]：模型第二主成分的可解释性；所有样本都在95%置信区间内；（B）OPLS-DA排列检验图（200次，R2Y = 0.9，Q2 = -0.77）。所有左边的Q2值都小于右边的原始Q2值，说明模型有效；（C）火山图表示上调（红色）和下调（蓝色）的代谢物：（D）代谢途径的气泡图；每个气泡代表一个代谢途径；横坐标和气泡大小代表该通路在拓扑分析中的影响大小，纵坐标和气泡颜色代表富集分析的P值；（E）Z-score图；Z-score用于衡量每个样品中相同水平代谢物的相对含量；（F）氨酰-tRNA 生物合成的代谢途径图；以红色显示的代谢物是PS组中浓度较低的差异代谢物；（G）D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢的代谢途径图；红色表示的代谢物在两组之间具有统计学意义；PS组中红色的代谢物下调；（H）相关性热图；每个方块代表Pearson的相关系数（r）；红色和蓝色分别表示正（0 < r < 1）和负（-1 < r < 0）相关。

3.3 宿主-微生物相互作用分析

本研究采用Spearman相关性分析和Sankey图进行相关性分析（图5）。如图5A所示，Th2细胞比例与普氏菌属（ρ = 0.64）、苯丙酮酸（ρ = 0.80）、4 - 羟基苯丙酮酸（ρ = 0.72 ）呈正相关，与2-氧代戊二酸（ρ = -0.81）、谷氨酰胺（ρ = -0.62）、N-乙酰天冬氨酸（ρ = -0.66）、MyD88 的表达（ρ = -0.49）呈负相关。TLR- MyD88轴与Th1细胞比例（ρ = 0.58，ρ = 0.81 ）、放线菌门相对丰度（ρ = 0.4，ρ = 0.56 ）、氨基酸如谷氨酰胺（ρ = 0.44，ρ = 0.72）、L-酪氨酸（ρ = 0.55，ρ = 0.75）呈正相关，但与Th2（ρ = 0.04，ρ = -0.49 ）、Th17（ρ = -0.30，ρ = -0.71）细胞比例呈负相关。与网络图表相比，Sankey图显示的内容更详细、更具体，并更直观地呈现了状态、位置或步骤。我们用血清指标、器官指标和微生物标志物展示了Sankey图（图5B）。我们采用血清、器官和微生物指标展示了图5B中的一个Sankey图。从图中可以分析出一些有价值的关联规则。例如，血清中免疫因子分泌异常是引起器质性病理变化的主要原因，而这些病理变化与细菌和代谢物密切相关。尤其是前伏菌和谷氨酰胺可能发挥重要的调控作用。这些调控网络通过阐明宿主免疫与微生物素之间的相互作用揭示了PS的免疫毒性机制。从图中可以分析出一些有价值的关联规则。例如，血清中免疫因子分泌异常是引起器质性病变的主要原因，而这些器质性病变与细菌和代谢物密切相关。尤其是，普氏菌属和谷氨酰胺可能发挥重要的调节作用。这些调节网络通过阐明宿主免疫与微生物之间的相互作用，揭示了PS的免疫毒性机制。总之，这些结果表明了考虑PS对肠道微生物预期影响的重要性，以便了解PS的最终命运及其对人类健康的风险。宿主、免疫和微生物因子的综合特性可以最终用于预测外源性药物动力学，并为制定治疗干预措施提供参考。

图5. 宿主-微生物相互作用分析。（A）相关性热图；每个方块代表 Spearman相关性系数；红色和蓝色分别表示正（0

4 构建分类算法模型以识别与PS相关的免疫缺陷

为了检验纳米聚苯乙烯相关免疫失调与对照的区分效果，我们构建了一种基于随机森林分析的分类算法。随机森林分析通常用于解决‘p值较大，n较小’问题。在本研究中，我们定义了一个与肠道微生物相关的特异性分子图谱，可以从组合数据中识别小鼠PS相关免疫紊乱的可能性。鉴于参数的重要性，我们用ROC评估了它们的诊断价值。在这个模型中，我们发现肠道变量IL-4、IL-12p70、Th1、Treg、DEGs和粪便代谢物（AUC = 1.000，95% CI = 1.000-1.000）、Th2（AUC = 0.94，95% CI= 0.816-1）和 Th17（AUC = 0.972，95% CI= 0.895-1）具有很高的准确性，为诊断提供了新的生物标志物。同时，变量放线菌门（AUC =0.889，95 % CI= 0.660 - 1）、普氏菌属（AUC =0.889，95 % CI = 0.660 - 1）、Eisenbergiella属（AUC = 0.750，95 % CI = 0.418 -1）、Intestinimonas属（AUC = 0.861，95 % CI = 0.641 -1）的预测能力具有一定的准确性。联合诊断模型的AUC为1.000，证明了其有效性（图6）。在临床应用中，可以根据实际情况选择最佳辅助诊断模型。这项研表明了PS暴露小鼠特定的免疫表型，将来可能对该患者群体的靶向治疗有重要的意义。

图6。受试者工作特征（ROC）曲线表示了各参数的准确性；每个ROC曲线的AUC代表PS暴露前后小鼠正确区分的预测值。（A）ROC（血清细胞因子和脾脏 CD4 + T 细胞）；（B）ROC（肠道中的差异表达基因）；（C）ROC（粪便微生物）；（D）ROC（粪便代谢组学）；（E）联合诊断ROC。

结论

目前，虽然很少有人关注PS摄入对哺乳动物的影响，但PS可能对机体多种器官造成损伤。PS可在PS暴露下小鼠的大脑、心脏、肝脏、肠道、子宫和卵巢中积累。可以在暴露于PS的小鼠中观察到能量代谢受损，肝脏中乳酸脱氢酶（LDH）活性显著增加。PS还诱导和增强血小板的聚集，这增加了心血管疾病的风险，并对源自小鼠大脑的原代细胞具有神经毒性。此外，5 μm的PS可减少小鼠肠道黏液分泌，破坏小鼠肠道屏障功能。有新的数据表明，PS可能通过与环境有关的接触途径表现出免疫毒性。有趣的是，短双歧杆菌M-16V主要在本研究中观察到具有免疫调节作用。此外，短双歧杆菌M-16V可以通过改变肠道微生物来缓解食物过敏。在本研究中，我们探讨了PS对宿主免疫和肠道微生物的影响，以及通过多组学分析评估PS对小鼠可能造成的健康问题。我们还试图揭示短双歧杆菌 M-16V在维持宿主免疫系统和肠道微生物组成之间平衡中的重要作用。我们的结果表明，PS改变了肠道微生物组成，扰乱了氨基酸合成，增强了Th2炎症反应，导致宿主免疫紊乱。更重要的是，研究结果支持了PS与微生物相互作用可以成为独特的微生物生境。而短双歧杆菌 M-16V显示出对Th2和Th17淋巴细胞亚群的抑制作用，伴随着MyD88表达的激活和IL-12的产生。此外，短双歧杆菌 M-16V 可以通过降低普氏菌属、Eisenbergiella属和Intestinimonas属的相对丰富度来部分恢复肠道微生物的生态失调。结果表明，短双歧杆菌 M-16V通过宿主-微生物相互作用具有一定的抗炎和免疫调节功能。由微生物产生或转化的微生物源分子是与免疫细胞对话的主要参与者。失去有节律的宿主-微生物组相互作用会破坏宿主的免疫功能，增加炎症和代谢并发症的风险。研究与PS暴露相关的微生物代谢途径不仅可以阐明微塑料的药代动力学特征，而且有可能揭示新的病原学观点。同时也为短双歧杆菌M-16V治疗策略的制定提供了理论依据。综上所述，本研究的结果揭示了微塑性污染与免疫紊乱之间提供了潜在的关联。将代谢组学与更多的组学分析联系起来可能有助于新的发现。

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