科研 | EBioMedicine：循环外泌体和肠道微生物群诱导间歇性缺氧小鼠胰岛素抵抗：体力活动的影响

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作者：微生态

编译：微科盟张欢，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读

背景：肠道微生物（GM）能够导致肥胖和胰岛素抵抗（IR）。阻塞性睡眠呼吸暂停 (OSA) 以间歇性缺氧 (IH) 为特征，促能够进IR，改变GM。由于循环外泌体与IR有关，我们检测了IH和小鼠体力活动 (PA) 对GM、结肠上皮通透性、全身IR和血浆外泌体负荷的影响，以及外泌体对内脏白色脂肪组织 (vWAT) IR的影响。

方法：C57BL/6小鼠在有体力活动与无体力活动的情况下暴露于IH或室内空气 (RA) 6周 (n = 12/组)，评估GM和全身IR变化，以及血浆外泌体对naïve脂肪细胞胰岛素敏感性的影响。在naïve小鼠中进行粪便微生物群转移(FMT) (n = 5/组)，然后进行粪便16S rRNA测序，评估全身性IR和外泌体诱导的脂肪细胞对胰岛素敏感性的影响。 结果：主坐标分析 (PCoA) 纵坐标显示接受IH和FMT的小鼠间的B-多样性，这种多样性占总方差的64% (PC1) 和12.5% (PC2)。IH暴露和IH-FMT处理的优势菌系和属得以保存，IH暴露的GM和IH-FMT诱导了肠道通透性的增加。与IH+PA或RA FMT处理的小鼠相比，IH暴露和IH- FMT处理的小鼠的血浆外泌体降低了脂肪细胞中pAKT/AKT对外源性胰岛素的反应 (p = 0.001)。 总结：IH暴露模拟了OSA诱导的GM的变化，增加了肠道通透性并改变了血浆外泌体负荷，从而改变了的外泌体负荷，后者诱导脂肪细胞功能障碍 (增加IR)。而且，体力活动改善了这些改变。因此，如IR所反映的，IH导致单一GM-循环外泌体通路的紊乱，这种紊乱破坏了脂肪细胞稳态，进而导致代谢功能障碍。

论文ID

原名：Circulating exosomes and gut microbiome induced insulin resistance in mice exposed to intermittent hypoxia: Effects of physical activity

译名：循环外泌体和肠道微生物群诱导间歇性缺氧小鼠胰岛素抵抗：体力活动的影响

期刊：EBioMedicine

IF：8.143

发表时间：2021.1.21

通讯作者：Abdelnaby Khalyfa & David Gozal

通讯作者单位：美国密苏里大学医学院

DOI号：10.1016/j.ebiom.2021.103208

实验设计

结果

1．IH导致了瘦小鼠全身性改变

与暴露于RA的小鼠相比，暴露于IH小鼠的体重 (BW) 更低 (p = 0.001；n = 12/组)，而与暴露于IH+PA 的小鼠相比暴露于IH的小鼠BW更高 (p = 0.02；n = 12 /组)。相比之下，RA+PA组小鼠的BW较RA组低【p = 0.01， n = 12/组；(双因素方差分析，ANOVA) 】(图1b) 。

暴露于IH的小鼠对胰岛素的反应与RA组小鼠的反应不同；p = 0.01 ，而且这种效果能够通过运动（EX）得以改善 【IH vs. IH+PA： p = 0.01 (重复测量的双因素方差分析，ANOVA】（图1c)，表明小鼠暴露于IH导致了全身性的IR。

一项对几种炎症标记物的评估（图1d) 表明，与IH+PA组小鼠相比，暴露于IH的小鼠的vWAT的CD11c表达增加（图1d) , n = 8/组；p = 0.031，（双因素方差分析，ANOVA)。此外，western blot检测结果显示，与IH+PA组或RA组小鼠相比，IH组小鼠的其他巨噬细胞和内皮相关蛋白，如CD31、CD146和TIE2表达明显增加，表明IH可增强vWAT内血管化和炎症细胞的募集，而PA可减弱这些作用（图1d和1e）。

图1 简图描述了小鼠在慢性间歇性缺氧 (IH) 或室内空气 (RA) 条件下有和没有体育活动的影响。

（a）IH诱导粪便微生物群改变，表现为增加了体内和体外结肠上皮的通透性，并导致引起胰岛素抵抗的循环外泌体功能特性的改变。实验组的粪便微生物群转移重现了这些发现，包括PA的有益作用。

（b）各组小鼠分别暴露于RA、RA+EX、IH和IH+PA 6周（有或没有体力活动，EX）的平均体重 (n = 12；* -p＜0.01)。*表示IH vs IH+PA或RA vs RA+PA。

（c）ITT显示与RA组小鼠相比小鼠暴露于IH诱发了胰岛素抵抗，而PA能改善这一作用。

（d）对4个实验组的vWAT蛋白【CD11c (M1巨噬细胞)、CD146 (整合膜糖蛋白)、CD31 (细胞粘附分子) 和TIE2 (TEK酪氨酸激酶)】的western blot分析。这些结果代表了8个不同的实验。

（e）将β-肌动蛋白归一化作为加载对照后各实验组的密度测量信号强度汇总。于RA和IH+PA组相比，IH组小鼠的CD11c蛋白表达明显增加（p=0.01）。结果以倍数改变表示，表示为平均值±SD，n = 8/组，*p = 0.01。重复测量体重和ITT的双因素方差分析 (ANOVA)： ** - p＜0.01， n = 12/组。数据显示为平均值±SD。*表示IH组与HI+PA组，以及IH组与RA组相比具有显著差异。

2．粪便微生物群对小肠上皮细胞屏障破坏的影响

细胞被暴露于所有暴露组小鼠的粪水中，与IH+PA相比，IH相关的粪便代谢物显著破坏了细胞的跨膜阻力 (p＜0.004)。然而，与RA和RA+PA相比，两种IH条件都增加了细胞单层屏障的通透性 (p = 0.003， n = 12/组，双因素方差ANOV，图2a和2b)，表明IH诱导的肠道微生物组和代谢组的变化对上皮细胞通透性有不同的影响。

图2 将从暴露于IH或RA后6周 (含PA和不含PA) 的小鼠提取而来的粪便水添加到小鼠的单层肠上皮细胞中，使用电细胞-底物阻抗感应 (ECIS) 评估细胞跨膜阻力的变化。（a）从0时刻起用粪便水处理后，小鼠单层肠上皮细胞的标准化抗性随时间的平均变化。

（b）小鼠肠上皮细胞暴露于来自各实验组小鼠的粪水24h后的平均肠上皮细胞单层阻力的变化。数据显示为平均值平均值±SD；n=12/实验条件，* p = 0.003，** p = 0.0001。应用的是用于非重复检验的双因素方差分析。对照组表示未用粪水处理的细胞。

3. IH和PA与肠道微生物改变有关

我们检测到了显著运动依赖的丰富度 (图3a) 和α-多样性 (图3b) 的增加 (使用Holm-Sidak方法进行事后比较的双因素方差分析)。在门水平上，在暴露于RA的小鼠中，厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著增加（图3c），然而，暴露于IH则分别与Patescibacteria门（p < 0.001， F = 15.27）和 软壁菌门Tenericutes（p < 0.001， F = 38.4）的增加和减少有关。

在更精细的分类水平上 (图3d)，29个操作分类单位 (OTUs) 的相对丰度检测到依赖IH的显著差异 (单向排列多变量方差分析，PERMANOV) (补充表1)。除了2种乳酸杆菌Lactobacillus spp.、2种α-变形菌门α-Proteobacteria和Candidatus Saccharimonas外，在IH暴露小鼠中存在较多的类群大部分属于拟杆菌门，而RA暴露小鼠的类群主要是厚壁菌门，包括三个不同的真杆菌菌株，以及瘤胃球菌科和毛螺菌科的其他几个成员。考虑到EX相关的差异，33个OTU中有21个在运动小鼠的样本中更为丰富，其中主要包括厚壁菌门，另外还有分别属于放线菌门和拟杆菌门的一个OTU。同样地，在来自运动小鼠样本中的相对丰度较低的12个OUT中(36.4%)，有9个来自拟杆菌门。因此，IH增加了拟杆菌门Bacteroidetes和α-变形菌门 (α-Proteobacteria) 的丰度，降低了革兰氏阳性厚壁菌门的丰度。此外，PA与IH暴露 小鼠中减少了的许多相同OTUs的丰度增加有关。

通过排序比较β-多样性显示了IH (p = 0.0001，F = 13.7) 和运动 (p = 0.0001， F = 10.4) (单向排列多变量方差分析，PERMANOVA) (图3e) 的明显效果，与通过分层聚类方法反映出来 (图3f)。

图3 对暴露于IH和RA的小鼠（有或没有PA）粪便样本进行16S RNA分析的主成分分析、层次聚类、点图和堆栈柱状图。

（a）主成分分析，和（b）存在或不存在PA的情况下暴露于RA或IH的野生型小鼠的粪便的α-多样性，p < 0.05表组间有显著性差异（采用Holm-Sidak方法进行事后比较的双因素方差分析）。

（c）堆叠柱状图显示样品在门水平上在每个组内的分类分布（IH vs. RA： p = 0.17； F = 1.96；PA vs. ctl： p = 0.027； F = 5.22），和（d）具有突出分类单元标记的操作分类单元(IH vs. RA： p = 0.057； F = 3.82；PA vs. ctl： p < 0.001； F = 22.16)。

(e) 主成分分析，(f) 使用Jaccard相似性，按照无加权算术均数对组法 (UPGMA) 进行层次聚类，以观察不同条件下小鼠粪便微生物群之间的关系，n = 12/组。PCoA的统计比较采用单向排列多变量方差分析 (PERMANOVA)。

4. 粪便代谢物

基于粪便代谢组LCMS分析的主成分分析 (PCA) 检测到1858个化合物，根据暴露于IH明显区分了样品，而基于PA的差异最小 (图4a)。这些化合物的序列方差分析检测到25个化合物丰度的IH依赖性差异 (补充表2)。经过多次检验校正后，通过LCMS检测到的1858个化合物的序列方差分析检测到28个化合物 (28个化合物中的3个可能是同一代谢物的重复) 的丰度存在IH依赖性的差异 (补充表2)。因此，在发现的25种与IH有关的不同化合物中，21种化合物在IH暴露的小鼠中含量更高 (84%)，而25种化合物中只有4种 (16%) 在RA暴露的对照组小鼠中含量更高。所以，LCMS数据中所有四个治疗组之间的主要差异代表了与IH相关的升高的化合物 (9/12)，这些化合物要么通过PA正常化到控制水平 (5/12)，要么不考虑PA而保持在升高水平 (4/12)。

同时，GC-MS用于分析粪便样品的非极性和极性挥发分。虽然使用极性分数对样本进行排序时，没有观察到聚类 (数据未显示)，但基于GC-MS鉴定的非极性代谢组的主成分分析 (PCA) 显示样品IH依赖性的分离 (图4b)。在非极性组分中经GC-MS鉴定的238个化合物中，22个化合物中的的处理依赖性的差异均代表IH依赖性的增加 (补充表3)。在极性组分中鉴定的62个化合物中，只检测到了5个显著差异，均显示出IH依赖性的下降 (补充表4)。从IH暴露小鼠粪便检测出的处于升高水平的化合物的特性包括小分子如腺嘌呤（C5H5N5）和抑胃酶氨酸（C5H5N5），在蛋白酶抑制剂胃酶抑素的序列中发现的一种γ-氨基酸，以及几个极长的碳链化合物，其主链可达C64 (C64H101N7O30P2)。Tukey箱形图显示了十五烷酸 (C15：0) (图4c)；十六烷酸 (C17：0) (图4d)；丙二酸 (C3H4O4) (图4e)；和他汀 (C8H17NO3) 等的丰度 (图4f)。统计分析表明各因素的主效应和交互作用，基于双因素方差分析ANOVA，n = 12/组。

图4. 通过主成分分析和Tukey箱线图，研究了在伴/不伴PA条件下，RA和IH暴露6周后小鼠粪便代谢组的变化。(a) 通过超高压液相色谱-质谱 (UHPLC-MS) 对粪便代谢组进行主成分分析。(b) 气相色谱-质谱法，非极性。(c)显示十五烷酸丰度的杜克箱图 (C15:0) ; IH vs. RA: p<0.001; F19.3; PA vs. RA; p = 0.10; F = 2.8; 无显著交互作用 (p = 0.12)， (d) 十六烷酸 (C17:0)；IH vs. RA; p<0.01; F = 17.5; PA vs. RA; p = 0.049; F = 4.1; 交互作用：p = 0.04; F = 4.5， (e) 丙二酸 (C3H4O4); IH vs. RA: p<0.001; F = 67.8; PA vs. RA: p = 0.12; F = 2.5; 没有显著的交互作用; p = 0.74 和 (F) 他汀 (C8H17NO3); IH vs. RA: p<0.001; F = 17.3; PA vs. RA: p<0.001; F = 30.3;交互作用：p＜0.001; F = 17.2。统计分析表明每个因素和交互作用的主要影响，基于双因素方差分析ANOVA，n = 12/组。 5. 在未经免疫的小鼠中进行FMT

为了从其他系统效应中区别出GM介导的IH效应，我们将暴露于RA、IH和IH+PA的供体小鼠的粪便通过FMT移植到初始受体小鼠。通过对比暴露于RA、IH或IH-PA的供体小鼠的GM与接受FMT小鼠的GM，我们发现FMT成功地移植了GM。具体来说，我们在相应的FMT接受者中观察到IH依赖性的丰度 (补充图S1A) 和α-多样性 (图S1b) 的增加，PCA显示供体和同源FMT受体的紧密聚类，主要基于IH暴露的样本清晰分离 (图S1c和d)。

6. 来自IH暴露小鼠的外泌体对体外胰岛素敏感性和巨噬细胞的影响外泌体分离、定量和外泌体摄取如前所述 (补充图2和3)。为了在体外评价来自所有四个治疗组小鼠的血浆的外泌体对胰岛素敏感性的影响，分化的脂肪细胞 (3T3-L1) 在缺乏FBS的条件下，用相同数量的外泌体 (30 μg) 处理24小时，然后用5 nM或0 nM胰岛素处理，然后用western blot检测AKT的磷酸化水平。与IH+PA组小鼠相比，胰岛素治疗导致的p-AKT表达量相对于AKT总表达量的增加在IH组小鼠中显著减弱(图5a和b)。而RA组与RA+PA组小鼠之间的差异不具有显著性。除探究外泌体对naïve脂肪细胞的影响外，我们还研究了外泌体对naïve巨噬细胞的影响（图5c）。IH组小鼠来源的外泌体使巨噬细胞极的性向M1转化 (CD11c阳性；与RA相比：p = 0.029；n = 6/组)，IH+PA组与IH组相比，这种影响时降低的：p = 0.041；RA组与RA+PA组比较无显著性差异 (n = 6/组)（双因素方差分析ANOVA）。

图5 从暴露于IH或RA（伴或不伴PA）的小鼠的血浆中提取的外泌体对naïve脂肪细胞胰岛素敏感性的影响。（a）血浆外泌体处理后，再用5 nM外源性胰岛素处理30分钟后，pAKT和tAKT的代表性Western blot图。（b）pAKT/tAKT平均比值，每个实验条件n=8。（c）使用流式细胞术检测血浆外泌体对naïve巨噬细胞 (RAW 264.7) CD11c表达的影响。使用相同数量的每种实验条件下的外泌体 (20 × 106)。* 表示IH组与IH+PA组比较有统计学意义，p<0.05， n = 8/每种实验条件。非重复测量采用双向方差分析 (ANOVA)。NS表示差异不显著。

7. FMT、血浆外泌体、脂肪细胞和全身胰岛素敏感性与来自FMT+IH+PA或RA作为供体接受FMT的小鼠相比，来自IH作为供体接受FMT的小鼠的IR显著增加 (FMT+IH：3.58±0.81；FMT + IH + PA：2.71±0.34；IH vs IH- PA p = 0.008；Ra：1.98±0.29；RA vs. IH： p = 0.002)，(双因素方差分析ANOVA)，因此，在未暴露于IH的小鼠中重现了与暴露于IH的小鼠相同的效果。 这些数据表明IH对IR影响是通过GM调节的。 我们还研究了来自接受FMT小鼠的血浆外泌体对naïve脂肪细胞的影响。与从暴露于IH的小鼠获得的血浆外泌体的影响相似，磷酸化AKT (pAKT)/总AKT显著减少，与FMT+IH+PA相比，FMT+IH组发生tAKT比率 ( p = 0.001, n = 5)。与暴露于IH的小鼠的血浆获得的外泌体的影响相似，磷酸化AKT (pAKT)/总AKT (tAKT比值在FMT+IH+PA组发生，与FMT+IH+PA组相比 ( p = 0.001， n = 5)，和FMT- PA ( p<0.001； n = 6)，(双向方差分析ANOVA)，而FMT+RA组与RA组来源的外泌体效果没有明显差异 (图6a和b)，这表明 来自IH小鼠的FMT在从未暴露于IH的naïve瘦小鼠中诱导了胰岛素抵抗。通过GM介导的HR对IR的影响也依赖于IH诱导的血浆外泌体的变化。

图6 粪便微生物群移植（FMT）对体外胰岛素敏感性的影响。

使用暴露于IH或RA 6周（伴或不伴PA）的小鼠的粪便浆液进行FMT，在受体naïve小鼠中进行为期3周的FMT，然后收集血浆样本，分离出外泌体。在体外将相同数量的外泌体 (20 × 106) 应用于naïve脂肪细胞 (3T3-L1) 细胞24小时，然后通过添加5nM胰岛素30 min检测胰岛素敏感性。

（a）外泌体和胰岛素处理后脂肪细胞中pAKT和tAKT的代表性Western blot检测(每个实验条件下n = 5)。

（b）在naïve小鼠脂肪细胞 (3T3-L1) 中经FMT受体外泌体处理后，pAKT/tAKT平均比值表明FMT- IH组小鼠的胰岛素敏感性比所有其他组都降低 (每个实验条件下n = 5)。非重复测量采用双向方差分析 (ANOVA)。*表示p是＜0.05。NS表示差异不显著。

8. FMT和通透性实验最后，当在体内使用右旋糖酐- FITC检测时，来自IH供体的FMT-受者(FMT+IH)与来自RA供体的FMT-受者相比 ( p = 0.003， n = 8)（双向方差分析ANOVA），肠道通透性显著提高（图S4）。

综上所述， 这些结果表明IH对IR的影响依赖于在肠道屏障功能被破坏的情况下GM的组成和功能的改变，以及同时发生的血浆外泌体货物含量的变化。

讨论

在这项研究中，我们发现了暴露于IH的小鼠的GM中一致且稳定的基于16S的分类和代谢组学变化，这些变化促进了肠道上皮通透性的增加，而体力活动可部分逆转肠道上皮通透性的这种变化。与此同时，我们也总结了之前的发现和其他人发现，即慢性IH暴露促进了全身性的IR和vWAT中炎症的出现，并且我们现在首次表明这些变化可以通过有规律的身体活动来减弱。此外，我们发现，来自暴露于IH和RA的瘦小鼠的外泌体在naïve脂肪细胞中诱导了IR，并且在体外试验中促进了naïve巨噬细胞的M1极化，而PA使外泌体货物的功能特性最小化。最后，为了对一个概念：IH的影响可能至少部分是由GM-血浆外泌体通路介导的进行证明，我们开展了FMT实验，结果发现GM被修饰成与IH诱导的GM类似的改变的但并没有暴露于IH的naïve小鼠表现出对胰岛素的敏感性降低 (即HOMA-IR增加)，并在naïve脂肪细胞上携带诱导IR的血浆外泌体 (图1a)。在人类进行的类似研究也支持这一观点。因此，慢性IH模仿睡眠呼吸暂停 (以及其他呼吸疾病) 中发生的氧合振荡，导致假定的GM-循环外泌体途径的重大改变，最终破坏脂肪细胞稳态，导致代谢功能障碍，如IR所反映出来的那样。另外，我们还发现，与当前常规非剧烈活动指导方针相对应的运动将导致GM-外泌体途径的实质性改善。因此，我们提出，在鼓励定期运动的同时，针对OSA中GM的新治疗方法可能逆转与这种高度流行疾病相关的高心脏代谢风险。

我们的研究结果显示，暴露于IH的小鼠的IR和vWAT M1巨噬细胞增加，同时PA能改善以上现象，表明vWAT可能在代谢调节中发挥中心作用，vWAT的慢性低度炎症是IR出现的关键过程。然而，未经治疗的OSA患者的临床报告显示IR的进展性恶化，以及与OSA严重程度相关的代谢综合征，与肥胖无关。确实，肥胖是OSA发生的主要危险因素之一。但是，肥胖和阻塞性睡眠呼吸暂停的混淆作用是难以摆脱的，因此我们最初的研究是在非肥胖小鼠中进行的。毫无疑问，未来的研究需要纳入肥胖小鼠，并解决肥胖和睡眠呼吸暂停的共同作用的问题，以进一步了解人类疾病的独立和相互依赖的关系。我们还应该强调，除了OSA，其他疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、间质性肺疾病、特征性肺纤维化和限制性肺疾病，在氧合方面也表现出昼夜波动，间歇性缺氧最可能出现在睡眠期间，因此有可能将我们的研究范围扩大到许多其他相关的医疗状况。值得注意的是，在健康志愿者、瘦小鼠和暴露于IH的培养脂肪细胞中，已经有研究报道了胰岛素敏感性下降。IH还导致其他vWAT变化，如基因表达修饰、脂蛋白清除途径的改变和血管稀疏，所有这些都在代谢调节和IR的出现中发挥中心作用。然而，IH在全身和vWAT中诱导的代谢紊乱产生的机制过程尚不清楚。越来越多的现存文献清楚地表明，GM影响肝脏、肠道、大脑、骨骼肌和vWAT的多种代谢过程，并且GM的特定改变促进代谢和心血管疾病以及肥胖的发生和进展。GM中的多种元素与肥胖、胰岛素敏感性和葡萄糖代谢有关；更具体地说，厚壁菌门和拟杆菌门参与了宿主能量代谢的控制，包括碳水化合物、脂质和胆汁酸代谢。革兰氏阳性厚壁菌门 (GPF) 和革兰氏阴性拟杆菌门 (GNB) 在GM中占主导地位，而厚壁菌门/拟杆菌门比值的不平等与炎症和免疫功能紊乱、肥胖和代谢性疾病有关。我们发现在IH环境中，OTUs的一个亚群增强，包括革兰氏阴性拟杆菌门 (Bacteroidetes) 内的类群，包括Bacteroides sp.、Parabacteroides sp.、Muribaculum sp.和Rikenella sp.；乳酸菌属作为唯一的厚壁菌门成员，以及Rhodospirillales目中未解决的α-Proteobacteria。相比之下，暴露于常氧条件的小鼠在以GPF为主的门中拥有更大的多个类群相对丰度，包括几种Lachnospiraceae和Ruminococcaceae，它们与短链和长链脂肪酸代谢相关。乳杆菌和梭状芽孢杆菌与IR相关，肥胖儿童中厚壁菌与拟杆菌门的比例高于正常体重儿童。因此，由血氧含量的偶发性变化引起的GM改变与代谢相关，通过对微生物组多样性 (丰富度、Shannon多样性和逆Simpson多样性) 和代谢组复杂性的改变以及运动的针对性干预，可能会促进这些改变的可逆性。在健康的动物中，运动被发现改变了微生物群的分类组成，运动训练也改变了正常和糖尿病小鼠的GM。

在IH暴露的小鼠中丙二酸水平的下降是值得关注的，因为辅酶A衍生物-丙二酰辅酶A，在脂肪酸合成中的脂肪酸 (FAs) 的延伸过程中起着关键作用。丙二酸的水平是由相对的生产速率 【由原核细胞和宿主细胞表达的乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)控制】 和FA合成的消耗决定的。因此，对IH暴露小鼠丙二酸水平下降的另一种解释是：由于ACC活性或乙酰辅酶A底物的降低，导致丙二酸的产量下降，以及脂肪酸合成中丙二酸的使用和同化增加。通过LCMS从IH暴露的小鼠样本中检测到如此多的长链FAs (VLCFAs) 表明前一种解释比后一种解释更有可能，尽管可能的解释并不相互排斥，只是推测。通过GCMS检测的两种非极性化合物包括十六烷 (C:17) 酸和十五烷 (C:15) 酸。棕榈酸是特别相关的，在之前的两种动脉粥样硬化的敲除小鼠模型中，棕榈酸是与IH相关的。C15:0和C17:0的升高被认为是一种代谢危险因素，在分化的脂肪细胞3T3细胞中，C15:0和C17:0均高于未分化的细胞。然而，十五烷酸也是一些细菌细胞壁的脂肪酸组成部分，粪便中大量的脂肪酸含量并非来自于饲料，这一事实可能是由于GM介导的产生或释放的差异导致摄入同一种饲料的组之间的差异。另一种可能是由于宿主胃肠道管腔摄取减少甚至分泌活跃，这是脂肪分解增加、循环游离脂肪酸 (FFAs) 和与IH诱导的代谢功能障碍相关的脂肪毒性的组成部分。因此，我们当前的工作显示IH暴露小鼠的肠道微生物和代谢组学均发生了改变，并且通过增加肠上皮细胞通透性而损害肠道功能，考虑到IH导致的紧密连接完整性的降低和血浆LPS水平的增加，肠道功能损害也可能是通过肠道菌群易位而导致的。此外，规律的PA显著改善了IH引起的这些变化。

近年来出现了GM对代谢稳态的影响的报道。肠道拟杆菌直接调节肠道功能，通过FMT可方便地实现胰岛素抵抗表型的转移。从人类健康非肥胖供体到肥胖IR患者的FMT可改善接受者的全身胰岛素敏感性。与瘦小鼠的菌群移植相比，从喂食高脂肪饮食 (HFD) 的肥胖小鼠中移植FMT到无菌接受者中显著增加了肥胖。正如我们在本研究中的FMT实验所示，在未暴露于IH的naïve小鼠中，IH诱导的变化的导致了IR的出现，从而证明了GM在PSA相关代谢风险中的作用。

这项研究让我们探索了两个基本问题：首先，间歇性缺氧是否会改变肠道微生物群。我们假设，IH诱导的肠道微生物群落的改变能够在操作上通过更多的能量摄取和在超生物体水平上调节宿主的能量代谢促进人类和动物模型的肥胖。肠道微生物群在包括脂质、胆固醇和胆碱在内的饮食前体的代谢中起着关键作用，GM的变化可能影响宿主的心脏代谢健康。由于OSA的特点是肠腔和粪便中氧含量的周期性变化，正如前所述肠道菌群会受到影响。

然而，在IH暴露的小鼠中GM的改变也可能至少在一定程度上是由于能够调节GM的间歇性缺氧触发的宿主免疫通路的补充。与正常氧的对照组相比，IH增加了GM的α-多样性，更具体地说，增加了厚壁菌门 (Firmicutes) 的丰度，减少了拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和变形菌门 (Proteobacteria) 的丰度，提示OSA患者中宿主和GM之间的生理相互作用可能被解除调控 (见图7)。我们不能排除这种可能性，即GM的变化反映了食性模式的改变。的确，饮食改变可以改变肠道微生物群。相反，GM的改变可以改变整体的食物消费。这两种可能性都值得进一步研究。

这项研究中一个显著的发现是，尽管IH暴露小鼠的体重有轻微但显著的减轻，但这些小鼠产生了胰岛素抵抗，而暴露于相同程度的持续缺氧实际上增强了胰岛素敏感性。如前所述，肥胖与IH之间的相互作用仍有待探索，并将成为未来研究的重点。

我们最近发现OSA患者的血浆外泌体改变了naïve脂肪细胞的胰岛素敏感性。尽管GM和代谢紊乱之间存在因果联系，但GM在改变循环外泌体货物中的潜在作用，从而作为IH诱导的IR增加的中间效应，此前尚未被探索。肠道微生物与宿主之间的相互作用涉及到一个复杂的信号通路网络。在IH暴露的小鼠中观察到的微生物群变化可能是由于宿主体内IH最初触发的系统免疫通路随后导致GM的变化而引起的。或者，IH会直接改变GM及其代谢产物，这可以从暴露于IH真实模拟的具有OSA患者特征的粪便特点的小鼠的粪便微生物群中观察到的细菌群落多样性的增加看出。然后，这种GM变化引起的肠道通透性增加将引发免疫反应的激活，最终导致影响全身胰岛素敏感性的外泌体货物的变化。我们的研究并没有回答这两种具体情况中哪一种与当前的发现有关，这些问题将在未来的研究中得到解决。免疫系统的破坏引起肠道屏障功能障碍，导致肠道微生物群或其产物通过肠道上皮细胞易位。在IH诱导的肠道失调的情况下，细胞外囊泡的产生于货物可能会改变和影响宿主的信号通路。此外，细胞外囊泡可以通过促进紧密连接的功能和通过TLR信号减少恶化的炎症反应来调节微生物环境和宿主的免疫反应。缺乏身体活动会增加罹患各种非传染性疾病的风险，因为它通常与肥胖有关，更具体地说，是在vWAT增多和发炎的情况下。有趣的是，缺乏运动也会增加外泌体水平，这与胰岛素抵抗和内皮功能障碍的恶化有关。相反，外泌体可能在运动和能量稳态之间的相互作用中发挥关键作用。因此，与PA有关的在GM变化与IH诱导的外泌体数目和功能方面的改善与假定的GM-外泌体途径兼容。FMT实验结果进一步为这一论点提供了支持证据。

现在已经确定的是，在动物和有代谢障碍的人类中GM都发生了改变，但是，哪些GM以及GM如何改变的代谢性疾病的发病机制，包括OSA的代谢性发病率，仍未被探索。我们认为GM宿主和外泌体之间的机制联系可能是双向的。我们的数据显示，IH和FMT都导致了全身各系统以及naïve脂肪细胞的IR，在naïve脂肪细胞是通过暴露于外泌体实现的。IH或FMT如何导致肠道通透性和释放外泌体进入循环的确切机制尚不清楚。然而，我们推测IH通过改变肠腔的miRNAs以及导致肠道通透性增加并促进肠道炎症的mRNA基因的表达而导致了GM的改变，反之，肠壁和循环中的免疫细胞的变化也可能促进肠通透性的变化。因此，这两种GM的改变都导致在循环中携带不同的货物的外泌体的增加，并增加了对末端器官(如eWAT) 的系统性影响，从而诱导IR (图7)。IH诱导的GM的特异性特征变化导致功能改变的外泌体的产生和释放的确切途径和机制不在当前工作的范围内，但显然具有治疗意义，因此，未来对GM的具体操作可能有助于预防与OSA相关的终末器官疾病。

作为本研究的局限性，有必要强调的是，我们尚未确定哪些由IH改变的外泌体货物是影响IR的基础。同样，我们也没有分离和提炼出哪些GM的变化导致了肠道通透性的变化，或者是导致IR的修饰外泌体“货物”的产生。独立地说，由于外泌体携带高度复杂的“货物”，包括miRNA、mRNA、脂质、蛋白质和DNA，这些工作将在未来使用多组学方法进行开展。此外，我们还没有探索患有或不患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的非肥胖和肥胖的人类。

综上所述，在瘦小鼠中模拟OSA的IH暴露导致了GM的一致和可识别的变化，增加了肠道通透性，改变了血浆外泌体负荷，正如FMT实验所示后者似乎是OSA诱导IR的效应因子。IH对GM-外泌体通路的影响诱导了全身和白色脂肪组织IR，而PA可改善这些改变。因此，在OSA患者中，宿主和肠道菌群之间的稳态关系可能受到损害，OSA相关代谢发病率可能不仅受益于生活方式的改变，如PA，还受益于其他靶向GM的干预措施，这些措施可能包括前益生菌和益生菌或特定的饮食调节。

图7. 暴露于IH的小鼠的肠道菌群和外泌体之间假想的双向相互作用，最终导致eWAT功能障碍和胰岛素抵抗。

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