科研 | 湖南大学：内生菌YG-14联合污泥生物炭增强刺槐镉的植物稳定性和根际细菌多样性

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作者：微生态

编译：微科盟Erics，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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导读

刺槐是一种最早在矿区种植的木本豆科植物，被公认为各种重金属（HM）的显著积累者。与其他有害重金属相比，刺槐对镉（Cd）的积累能力较低，可能影响植物修复效率。为了提高刺槐对Cd的吸收效率，已经报道了各种根瘤菌和丛枝菌根真菌的个体效应，但对内生菌和生物炭联合作用的影响很少受到关注。在本研究中，研究了一种吸附Cd的内生菌Enterobacter sp.。本研究将吸附Cd的内生菌YG-14接种到刺槐上，发现其能显著提高刺槐对Cd的吸收作用，这可能是因为该菌株通过分泌铁载体/LMWOA（低分子量有机酸）增强了根系对Cd的螯合。此外，将富磷污泥生物炭与YG-14联合使用，形成一个组合的生物炭-内生菌蓄积体系，加强生物矿化能力（即产生CdCO3和Cd2P2O7），使根际中的总Cd和酸溶态Cd含量分别减少61.75%和69.01%。此外，土壤细菌多样性进一步提高，固氮微生物生物标志物多样化。本研究发现了多种协同效应（E>0），且与对照组相比，植物生长参数增加了39.61%–561.91%。此外，该系统表现出较好的Cd植物稳定能力，Cd积累增加较多（81.42%），且从根部到地上部的易位显著减少（72.73%）。

论文ID

原名：Enhanced Cd phytostabilization and rhizosphere bacterial diversity of Robinia pseudoacaciaL. by endophyte Enterobacter sp. YG-14 combined with sludge biochar

译名：内生YG-14联合污泥生物炭增强刺槐镉的植物稳定性和根际细菌多样性

期刊：Science of the Total Environment

IF：7.963

发表时间：2021.05.08

通讯作者：朱咏华

通讯作者单位：湖南大学生物学院；植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室

实验方法

本研究采用固定床热解器在700°C下热解污水污泥生产的商业化污泥生物炭（中国安徽芜湖）结合在铅/锌尾矿的植物修复场地生长的植物根部分离出来内生菌YG-14，探索生物炭-内生菌蓄积系统对刺槐及土壤Cd转化、生物有效性和微生物多样性的影响。设置盆栽试验，使用无菌生长基质+石英砂（1:1，v/v）进行。将400 mL Cd2+（35 mg L-1）添加到每个盆中并充分混合。将已灭菌的刺槐幼苗（三株）移植到每个盆中，四个处理组设置如下：CK（添加Cd的生长底物）、Biochar（添加5% w/w）、YG-14（每15天接种1 mL）、B+YG-14（添加5% w/w生物炭并接种YG-14），每个处理设置十次重复。在实验过程中，将植物置于温室中，室温25°C，持水量为60%，每15天向每个盆添加营养液，并在第60天采集植物进行后续分析。分别测定植物生物量、叶绿素和氮含量、根形态参数、光合作用速率、刺槐对Cd摄取，易位和积累量、根际土壤的总Cd含量，酸溶态Cd含量和pH值以及低分子量有机酸，采用高通量测序对微生物群落进行分析。

图文摘要

结果

1 增强刺槐Cd的植物稳定性1.1 植物对Cd的吸收、积累和转运本研究测定了植物对Cd的吸收、积累和易位（图1）。植物根系对Cd的吸收显示出有趣的结果，YG-14处理组中Cd的浓度最高达到36.60 mg kg-1，其次是B+YG-14处理组（20.64 mg kg-1）和CK对照组（9.91 mg kg-1），而Biochar处理组中Cd的浓度最低（7.60 mg kg-1）（图1B）。另一方面，各处理组地上部对Cd的吸收显著降低，B+YG-14处理组（4.88 mg kg-1）的浓度在各组中最低，相当于CK组（8.70 mg kg-1）的一半。总之，在生物炭和菌株处理后，Cd更倾向于被限制在地下而不是地上，TF指数（图1B）也证明了Cd的根茎易位能力。与CK组（0.88）相比，所有处理的TF值分别降低至0.71（Biochar）、0.18（YG-14）和0.24（B+YG-14）。进一步计算了整株植物积累的Cd含量（图1A），发现该值在处理组中显著增加（p<0.05），B+YG-14中的含量最高为5.50 μg/植株，其次是YG-14中的5.23 μg/植株、生物炭中的1.62 μg/植株和CK组中的1.02 μg/植株。有趣的是，在YG-14处理的刺槐中发现根对Cd的吸收量最高。诚然，B+YG-14处理组的根系中Cd浓度较低，这可能是由于土壤中生物炭对Cd的固定作用所致，因此，根部可同化的Cd比例相对较小。另一方面，我们推断内生接种物可以增强刺槐根系对Cd的积累。首先，菌株YG-14具有高抗Cd性，其对Cd的最小抑制浓度（MIC）为1000 mg L-1（8.90 mM），且与之前报道的其它菌株相比，该值较高，如表S1所示。其次，可以从EDS分析推断YG-1对Cd的吸附能力，因为在菌株表面观察到0.75%（w）的Cd（图2B），并且FTIR分析进一步发现了该菌株对Cd2+的生物吸附能力（图S1）。在Cd2+处理后，YG-14的大多数峰的振幅发生变化，表明菌株的表面官能团，如羧基、羟基、烷烃和酰胺基团有助于Cd2+的生物吸附。第三，将YG-14接种的无菌幼苗中重新分离，80%的YG-14菌株可以成功地在根中定殖（表S3）。结合菌株的上述金属吸附和定植特性，YG-14的接种可能是导致植物根系中Cd显著积累的主要原因。与此结果类似，据报道，感染常见内生真菌AMF的刺槐将大量Pb集中在菌根结构上，从而减少了地上易位。我们推断，定植在刺槐中的内生菌也可能与植物根部中的Cd具有类似的相互作用，从而保护了寄主植物。菌株YG-14（表S1）分泌的铁载体（37.40%）可能与螯合根部的重金属阳离子并最终抑制重金属易位到地上部有关。根部Cd滞留的另一个可能解释是，YG-14在Cd胁迫下增加低分子量有机酸的分泌（表1）。有机酸的产生可以形成Cd的有机复合物，这是根和地上部对Cd不同生物积累的重要螯合策略。综上所述，共生发现根系中Cd的含量显著较高（YG-14，36.60 mg kg-1），但地上部Cd的含量较低（6.49 mg kg-1），使得Cd从根部到地上部的易位急剧下降。

图1. 不同处理下刺槐对Cd的积累（A）、吸收和易位（B）以及土壤中Cd的浓度（C）；值代表平均值±标准差，（n=5）。根据Tukey检验，不同字母表示显著性差异（p <0.05）；CK：仅种植刺槐；Biochar：添加5%生物炭；YG-14：YG-14接种处理；B+YG-14：添加5%生物炭和YG-14接种处理。

‍图2. 在Cd（100 mgL−1）胁迫下生物炭（A-B）和YG-14接种生物炭（C-D）的SEM-EDS图像。

表1. 不同处理的根际土壤中和有无Cd胁迫下YG-14分泌的低分子量有机酸的组成和浓度。

1.2 刺槐的植物生长及抗镉性本研究测定了不同Cd处理下的刺槐幼苗的植物生长参数。与对照组相比，Biochar、YG-14和B+YG-14的处理组显著（p<0.05）促进了枝条长度（27.72-76.73%）和干重（197.77-561.91%）（图3A-B)。在刺槐的地下部分也发现了类似的结果，与对照组相比，根长（73.55-138.21%）和干重（109.18-404.26%）增加（图3A-B）。此外，B+YG-14比Biochar或YG-14处理组显示出更强的加速植物生长的能力。同时，不同处理组的刺槐根部的形态参数如图4所示。与对照组相比，结合或者单独的YG-14和生物炭处理可以通过增加根尖、分叉、交叉、表面积和体积来改善根的发育。由于植物生理活动直接受到金属毒性的影响，因而测定了光合作用和相关的氮和叶绿素含量（图3C-E）。与对照组相比，所有处理组的叶片净光合速率显著增加（p<0.05）（图3E）。B+YG-14处理组的净叶片光合速率最高（7.75 μmol CO2m−2 s−1）。与对照组相比，单独使用YG-14和生物炭提高了植物中总叶绿素和氮的浓度（图3C-D）。B+YG-14处理组的总叶绿素和氮浓度值最大，分别为22.64 SPAD和9.83 mg g-1。与对照组相比，接种YG-14后，植物的生长显著增加，尤其是地上部的重量和根长（65.51%和122.23%）、地上部和根生物量（392.48%和189.20%）、根体积和表面积（69.39%和36.02%）、光合速率（124.49%）、总叶绿素含量和相对氮含量（41.17%和26.25%）等指标。与从刺槐分离的许多根瘤菌相比，该菌株的良好性状（IAA和铁载体产生、P溶解、N2固定能力）（表S1）可以解释植物生长的显著改善。在高浓度Cd胁迫下，氮、磷的缺乏是阻碍植物生长的两个重要因素。菌株YG-14是固氮菌，接种YG-14后，植株枝条含氮量高于对照组。该结果与先前的文献一致，即各种固氮根瘤菌可以通过从大气中额外提供氮来增强刺槐的生长以抵抗各种重金属的胁迫。此外，与一些内生菌对刺槐的根生物量较小的影响相反，菌株YG-14显著改善了根系的发育，可以通过菌株的IAA分泌来解释（表S1），因为调节不同IAA水平可诱导根细胞伸长，刺激侧根和不定根的形成。深层根部系统可以更有效地获取氮和磷，最终促进植物地上部分的生长。YG-14的接种对植物根系发育的重要性也可能是由于与根瘤菌和病原体相比，内生菌对豆科植物的根部感染类型不同。然而，内生菌是否具有不同的根定殖机制仍值得进一步研究。生物炭的添加可以提高YG-14在有无Cd胁迫的土壤中的存活率（图S2），SEM分析（图2B）同样表明生物炭可以通过增加表面积和多孔结构成功地固定YG-14。这一发现与生物炭在压力条件下为微生物提供庇护和保护的说法一致。此外，污泥生物炭（表S4）是一种富含P（14.89 g kg−1）的生物炭，具有丰富的K、Fe、Ca、Mn含量，并且其营养资源优于许多其他生物质衍生的生物炭，且可以为细菌和植物的生长提供必需的元素。相较于对照组，污泥生物炭提供的额外养分可能对植物生长有更好的影响。我们还发现，污泥生物炭中Cu、Ni、Pb、As、Cr、Zn没有超过风险管控水平，且未检出Cd。此外，具有生物炭改良剂处理的植物对Cd的吸收显著（p<0.05）减少（图1B），这也可以通过减少植物吸收的重金属含量来促进植物生长。

图3. 不同处理下刺槐的生物量和光合参数。不同处理下刺槐的株高和根长（A）、干重（B）、总叶绿素含量（C）、氮含量（D）和净叶光合速率（E）。值代表平均值±标准差，（n=5）。根据Tukey检验，不同字母表示显著性差异（p<0.05）；CK：仅种植刺槐；Biochar：添加5%生物炭；YG-14：YG-14接种处理；B+YG-14：添加5%生物炭和YG-14接种处理。

1.3 YG-14和生物炭对Cd植物稳定的协同作用YG-14和生物炭的共同作用从以下几个方面增强了Cd的植物稳定性：（1）最大限度地提高植物的Cd积累；（2）增加根对Cd的吸收；（3）减少枝条中Cd浓度。我们计算了生物炭和YG-14对植物生长条件和金属吸收的交互作用，并展示在表2中，且列出了所有参数中的交互作用值，结果为积极作用（E>0）。结果表明污泥生物炭和内生菌YG-14的组合对植物生长和Cd的积累有显著的协同作用。与对照组相比，污泥生物炭和内生菌的组合使茎高和根长（76.73%和138.21%）、茎和根生物量（561.91%和385.25%）、根体积和表面（128.57%和 39.61%）、光合速率（197.30%）、总叶绿素含量和相对氮含量（63.25%和40.36%）有所增加（图3和4）。植物生长的改善可能会导致更高的重金属积累量，其中刺槐对镉积累量相对最高，为5.50 μg/植物，是对照组的5倍（图1A）。与其他重金属相比，刺槐通常吸收相对较少的Cd。然而，该组合促进了刺槐根部对Cd的吸收，同时，将地上部的Cd浓度降低到所有处理组中的最低水平（图1）。以下原因可以解释根中Cd吸收的增加和抑制：（1）这种组合有利于刺槐根系的生长，对根生物量具有最大的协同效应（E=40%）（表2）。这可以通过菌株的累积PGP特性和污泥生物炭提供的额外营养来解释。联合处理后，根部发育到最大的体积和表面积，这可以吸收比以前更多的Cd；（2）生物炭提供的一些必需营养素如不溶性的P、Si和K，微生物和植物的生物转化系统通过分泌蛋白质（即铁载体和低分子量有机酸）来同化这些元素。在Cd的胁迫下，养分获取的过程可能有助于刺槐根部对金属的吸收，如FTIR结果所示，添加Cd2+后，峰值强度达到1620 cm-1，代表键拉伸，且与B+Cd和Biochar相比，在1000-1300 cm-1范围内的峰值对应于多糖的C-C键和C-O键振动的特征在B+14+Cd中较强（图S1）。该发现也与XRD结果（图S3）一致，即化合物具有高溶解度（Ksp值约为10-12）。换句话说，在B+YG-14+Cd和B+Cd中均检测到CdCO3和Cd2P2O7，但金属矿物减少，表现为B+YG-14+Cd中这些峰的强度减弱。这表明一些酸性官能团与Cd离子发生相互作用，它们可能作为关键的金属螯合剂在根中同化和捕获更多的Cd阳离子，导致枝条中Cd浓度相对较低。综上所述，生物炭与YG-14联合处理促进了刺槐的Cd植物稳定作用。

图4. 不同处理对刺槐生长表型和根形态的影响。值代表平均值±标准差，（n=5）。根据Tukey检验，不同字母表示显著性差异（p<0.05）；CK：仅种植刺槐；Biochar：添加5%生物炭；YG-14：YG-14接种处理；B+YG-14：添加5%生物炭和YG-14接种处理。表2. 不同植物参数的相互作用。

2 对土壤Cd浓度、生物有效性和微生物多样性的影响2.1 根际土壤中总Cd的和酸溶态Cd的浓度不同处理组植物中Cd浓度和含量显著增加，相反，处理后的土壤Cd浓度与对照组相比均显著下降至60.22-64.37%（图1C）。对于酸溶态Cd也发现了类似的趋势。与对照组相比，三种处理的根际土壤减少了69.01-77.32%（图1C），表明处理后Cd的生物毒性减弱。通过削弱重金属的溶解性和流动性降低土壤Cd浓度和生物毒性，从而控制重金属的扩散风险。在Biochar、YG-14和B+YG-14中也检测到高于CK组土壤的pH值（图1C）。B+YG-14的pH值为7.0，是所有处理组中最高的，pH值的增加也可能导致金属生物利用度的降低。许多先前的研究还发现，在重金属胁迫下，当OH−因金属阳离子吸收过量硝酸盐而被诱导排出时，具有固氮共生体的植物根际pH值较高。本研究稍后将讨论固氮微生物。同时，根系分泌物，尤其是低分子量有机酸，经常影响植物对重金属的同化和生物毒性，因此，对刺槐根际土壤中的7种低分子量有机酸进行了检测，如表1所示。在YG-14和B+YG-14处理中，所有检测到的有机酸的浓度均降低。与pH值和酸溶态Cd的变化一致，有机酸值的下降也导致pH值升高，最终导致酸溶态Cd减少。苹果酸和柠檬酸在Biochar处理组中分别增加到132.76和347.78 μg kg-1，这将在后面进行讨论。2.2 根际土壤细菌群落的多样性和结构的变化与植物相关的根际微生物群落更完整地描绘了不同处理植物如何影响重金属修复。因此，本研究评估了α多样性指数以揭示受不同处理影响的微生物多样性水平（表3）。与CK组相比，Biochar、YG-14和B+G-14显著提高了细菌丰富度（Ace）、多样性（Shannon）和均匀度（Shannoneven）。Ace指数显示的最大丰富度在Biochar处理组中，为440.48，B+G-14处理组多样性指数较高为4.48。PCA分析进一步揭示了受不同处理影响的群落结构（图5A）。生物炭和联合处理的细菌群落比其他处理组更密集，表明这两个组具有相似的群落组成。由于这两个处理组均经过生物炭修饰，我们推断生物炭对细菌群落结构的影响大于YG-14的接种处理。如RDA分析所示，计算了11个环境因素，包括植物生长参数、Cd含量和土壤pH值（图5B），其中ShootCd（R2=0.80，P=0.003）、ExtraCd（R2=0.60，P=0.024）、pH（R2=0.56，P=0.0034）和TotalCd（R2=0.53，P=0.034）显著影响细菌结构和群落组成。该分析表明，CK组受ExtraCd、TotalCd和ShootCd的影响很大，而YG-14处理组受RootCd的影响严重。生物炭处理具有明显的分散趋势，因为Biochar和B+YG-14处理组不受Cd含量的影响，但受植物参数和土壤pH值的影响显着。我们推断，通过固定土壤中的Cd，符合公认的生物炭对金属固定效应，生物炭减少了Cd对土壤微生物群的影响。从污泥生物炭表现出的高表面积（29.88 m2 g-1）和多孔结构（表S4；图2A），以及生物炭和Cd的强化矿物结构（图S3），我们可以推断吸附作用和Cd2+在生物炭表面的沉淀可以部分解释土壤和植物中Cd的下降，因为与对照组相比，刺槐根系中Cd的积累减少了23.25%。此外，Biochar处理组中根际苹果酸和柠檬酸的值（表1）比对照组的增加幅度更大。据报道，柠檬酸和苹果酸对Cd2+转运的抑制作用非常强，因为柠檬酸和苹果酸在低分子量有机酸中具有更大的表面积、更广的覆盖范围和相对较高的分子量。因此，Cd2+可以被柠檬酸和苹果酸捕获，形成稳定的有机酸-金属络合物。总之，Cd胁迫对土壤细菌群落的影响降低，表明生物炭的引入通过减轻对微生态系统的Cd胁迫改善了土壤微生物的多样性和组成。除了α和β多样性评估外，还可以通过识别不同群体的特有细菌群落揭示群落组成，然后使用LEfSe分析从门到属水平搜索生物标志物（LDA>3），以Cladograms图进行展示（图6A和B）。与CK（34）和YG-14（33）组相比，Biochar（40）和B+YG-14（39）处理组中显著（LDA>3）富集的物种数量更多。有趣的是，B+YG-14处理组具有最多样化的固氮菌群（13种生物标志物），包括用nifD和nifH基因鉴定的浮霉菌门（Planctomycetes）和蓝细菌（Cyanobacteria），以及α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）。Biochar处理组中，属于蓝细菌（Cyanobacteria）和根瘤菌目的九种物种较为丰富。YG-14处理组中，四种来自变形菌门（Proteobacteria）的物种，即共生根际细菌：根瘤菌目（Rhizobiales）、Para/Neo/Rhizobium（属）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和Azospirillum（属）。9种属于根瘤菌目和伯克霍尔德菌科物种在CK组显著富集。B+YG-14处理组富集了更多具有固氮潜力的微生物，这一结果可能解释了根际显著（p<0.05）较高的pH值（图1C），因为固氮微生物可以诱导氢氧化物的释放，正如上面讨论的那样。

表3. OTU数量和Alpha多样性统计。

图5. 细菌群落PCA分析（A）和RDA分析（B）。PC1和PC2的值是相关轴可以解释的群落结构的百分比。相似性分析（ANOSIM）用于获得显著性水平P值和R值。RDA分析中的11个环境特征（红色箭头）是：酸溶态Cd、土壤中的Cd、根部的Cd、地上部中的Cd、总叶绿素含量、光合速率、表面积、植物高度、植物重量、根长和pH值。样品组（符号）为：CK：仅种植刺槐；Biochar：添加5%生物炭；YG-14：YG-14接种处理；B+YG-14：添加5%生物炭和YG-14接种处理。RDA1和RDA2的值解释相应轴的百分比。

图6. Cladogram图表示不同处理的根际相关的细菌谱系的系统发育分布（A）不同处理的根际相关的细菌群落中，LDA≥3的指示性物种。（B）不同颜色的区域代表不同的处理。圆圈表示从门到属的系统发育水平。每个圆的直径与该组的丰度成正比。CK：仅种植刺槐；Biochar：添加5%生物炭；YG-14：YG-14接种处理；B+YG-14：添加5%生物炭和YG-14接种处理。p：门，o：目，c：纲，f：科，g：属。

结论

作为主要定植于刺槐根部的内生菌，YG-14菌株在根部螯合了大量的Cd。添加生物炭促进了YG-14在不利环境中的定殖，且YG-14和生物炭组合的协同效应最大化促进使Cd积累和植株生长。此外，生物炭的引入可以通过诱导生物矿化过程来固定Cd，从而减弱Cd的生物毒性，使根际细菌群落和根瘤菌多样化。总之，生物炭-内生菌-植物复合体系为土壤Cd的植物稳定提供了一条新途径。

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